Quelle est la résolution d'un microscope ? Il vaut mieux voir une fois, ou une microscopie à ultra haute résolution. Tout sur le grossissement du microscope
2. Système optique du microscope.
3. Grossissement du microscope.
4. Limite de résolution. Pouvoir de résolution du microscope.
5. Grossissement utile du microscope.
6. Techniques spéciales de microscopie.
7. Concepts et formules de base.
8. Tâches.
La capacité de l’œil à distinguer les petits détails d’un objet dépend de la taille de l’image sur la rétine ou de l’angle de vue. Pour augmenter l'angle de vue, des dispositifs optiques spéciaux sont utilisés.
25.1. Loupe
Le dispositif optique le plus simple pour augmenter l'angle de vue est une loupe, qui est une lentille convergente à courte focale (f = 1-10 cm).
L'objet en question est placé entre la loupe et sa façade se concentrer de telle sorte que son image virtuelle se situe dans les limites d'accommodation pour un œil donné. On utilise généralement les avions d'hébergement lointain ou proche. Ce dernier cas est préférable car l'œil ne se fatigue pas (le muscle annulaire n'est pas tendu).
Comparons les angles de vision sous lesquels un objet est visible lorsqu'il est vu « nu » normale avec l'œil et avec une loupe. Nous effectuerons les calculs pour le cas où une image virtuelle d'un objet est obtenue à l'infini (la limite lointaine de l'accommodation).
Lors de la visualisation d'un objet à l'œil nu (Fig. 25.1, a), pour obtenir l'angle de vue maximum, l'objet doit être placé à la distance de meilleure vision a 0. L'angle de vue sous lequel l'objet est vu est égal à β = B/a 0 (B est la taille de l'objet).
Lors de la visualisation d'un objet avec une loupe (Fig. 25.1, b), il est placé dans le plan focal avant de la loupe. Dans ce cas, l'œil voit une image imaginaire de l'objet B", situé dans un plan infiniment distant. L'angle de vue sous lequel l'image est visible est égal à β" ≈ B/f.
Riz. 25.1. Angles de vision : UN- à l'œil nu ; b- à l'aide d'une loupe : f - distance focale de la loupe ; N - point nodal de l'œil
Loupe- rapport d'angle de vueβ", sous laquelle on peut voir l'image d'un objet à la loupe, à l'angle de vueβ, sous lequel un objet est visible à l’œil normal « nu » à la distance de meilleure vision :
Les grossissements sont différents pour les yeux myopes et hypermétropes, car ils ont des distances de vision optimale différentes.
Présentons sans dérivation la formule du grossissement donné par une loupe utilisée par un œil myope ou hypermétrope pour former une image dans le plan d'accommodation lointaine :
où une distance est la limite éloignée de l'hébergement.
La formule (25.1) suggère qu'en réduisant la distance focale de la loupe, vous pouvez obtenir un grossissement arbitrairement grand. En principe, c'est vrai. Cependant, lorsque la distance focale d'une loupe est réduite et que sa taille reste la même, des aberrations apparaissent qui annulent tout l'effet du grossissement. Par conséquent, les loupes à objectif unique ont généralement un grossissement de 5 à 7x.
Pour réduire les aberrations, des loupes complexes sont réalisées, composées de deux ou trois lentilles. Dans ce cas, il est possible d’obtenir une multiplication par 50.
25.2. Système optique du microscope
Un plus grand grossissement peut être obtenu en visualisant avec une loupe l'image réelle d'un objet créé par un autre objectif ou système de lentilles. Un tel dispositif optique est implémenté dans un microscope. Dans ce cas, la loupe s'appelle oculaire, et l'autre objectif - lentille. Le trajet des rayons dans un microscope est montré sur la figure. 25.2.
L'objet B est placé près du foyer avant de l'objectif (F environ) de telle sorte que son image réelle agrandie B" se trouve entre l'oculaire et son foyer avant. Lorsque
Riz. 25.2. Chemin des rayons dans un microscope.
Dans ce cas, l'oculaire donne une image imaginaire agrandie B", qui est visualisée par l'œil.
En modifiant la distance entre l'objet et la lentille, ils garantissent que l'image B" se trouve dans le plan d'accommodation lointaine de l'œil (dans ce cas, l'œil ne se fatigue pas). Pour une personne ayant une vision normale, B" est situé dans le plan focal de l'oculaire, et B" est obtenu à l'infini.
25.3. Grossissement du microscope
La principale caractéristique d'un microscope est son angle augmenter. Ce concept est similaire au grossissement angulaire d'une loupe.
Grossissement du microscope- rapport d'angle de vueβ", sous lequel vous pouvez voir l'image de l'objet dans oculaire,à l'angle de vueβ, sous laquelle l’objet est visible à l’œil « nu » à la distance de meilleure vision (a 0) :
25.4. Limite de résolution. Résolution du microscope
Vous pourriez avoir l’impression qu’en augmentant la longueur optique du tube, vous pouvez obtenir un grossissement arbitrairement grand et ainsi examiner les moindres détails d’un objet.
Cependant, la prise en compte des propriétés ondulatoires de la lumière montre que la taille des petits détails perceptibles au microscope est soumise à des restrictions liées à diffraction lumière passant à travers l’ouverture de la lentille. Du fait de la diffraction, l'image d'un point éclairé n'est pas un point, mais petit cercle lumineux. Si les parties (points) de l'objet considéré sont situées suffisamment loin, alors la lentille donnera leurs images sous la forme de deux cercles séparés et elles pourront être distinguées (Fig. 25.3, a). La plus petite distance entre les points distinguables correspond au « contact » des cercles (Fig. 25.3, b). Si les points sont situés très proches, alors les « cercles » correspondants se chevauchent et sont perçus comme un seul objet (Fig. 25.3, c).
Riz. 25.3. Résolution
La principale caractéristique démontrant les capacités du microscope à cet égard est limite de résolution.
Limite de résolution microscope (Z) - la plus petite distance entre deux points d'un objet à laquelle ils peuvent être distingués comme des objets séparés (c'est-à-dire perçus au microscope comme deux points).
L’inverse de la limite de résolution est appelé résolution. Plus la limite de résolution est basse, plus la résolution est élevée.
La limite de résolution théorique d'un microscope dépend de la longueur d'onde de la lumière utilisée pour l'éclairage et de ouverture angulaire lentille.
Ouverture angulaire(u) - l'angle entre les rayons extrêmes d'un faisceau lumineux entrant dans la lentille d'objectif à partir d'un objet.
Indiquons sans dérivation la formule de la limite de résolution d'un microscope dans l'air :
Où λ - la longueur d'onde de la lumière qui éclaire l'objet.
Les microscopes modernes ont une ouverture angulaire allant jusqu'à 140°. Si nous acceptons λ = 0,555 µm, alors on obtient pour la limite de résolution la valeur Z = 0,3 µm.
25.5. Grossissement utile du microscope
Voyons quel doit être le grossissement du microscope pour une limite de résolution donnée de son objectif. Tenons compte du fait que l'œil a sa propre limite de résolution, déterminée par la structure de la rétine. Dans la leçon 24, nous avons obtenu l'estimation suivante pour limite de résolution oculaire : ZGL = 145-290 µm. Pour que l’œil puisse distinguer les mêmes points séparés par un microscope, un grossissement est nécessaire.
Cette augmentation est appelée augmentation utile.
Notez que lorsque vous utilisez un microscope pour photographier un objet dans la formule (25.4), au lieu de Z GL, la limite de résolution du film Z PL doit être utilisée.
Grossissement utile du microscope- grossissement auquel un objet ayant une taille égale à la limite de résolution du microscope a une image dont la taille est égale à la limite de résolution de l'œil.
En utilisant l'estimation obtenue ci-dessus pour la limite de résolution du microscope Z m ≈0,3 µm), on trouve : G p ~500-1000.
Cela n'a aucun sens d'obtenir un grossissement plus élevé pour le microscope, car de toute façon, aucun détail supplémentaire ne sera visible.
Grossissement utile du microscope - c'est une combinaison raisonnable des pouvoirs de résolution du microscope et de l'œil.
25.6. Techniques spéciales de microscopie
Des techniques de microscopie spéciales sont utilisées pour augmenter le pouvoir de résolution (diminution de la limite de résolution) du microscope.
1. Immersion. Dans certains microscopes pour réduire limite de résolution l'espace entre la lentille et l'objet est rempli d'un liquide spécial - immersion. Ce microscope s'appelle immersion L'effet de l'immersion est de réduire la longueur d'onde : λ = λ 0 /n, où λ 0 - la longueur d'onde de la lumière dans le vide, et n est l'indice de réfraction d'immersion. Dans ce cas, la limite de résolution du microscope est déterminée par la formule suivante (une généralisation de la formule (25.3)) :
Notez que des lentilles spéciales sont créées pour les microscopes à immersion, car la distance focale de la lentille change dans un milieu liquide.
2. Microscopie UV. Pour diminuer limite de résolution Ils utilisent des rayons ultraviolets à ondes courtes, invisibles à l’œil nu. Dans les microscopes ultraviolets, un microobjet est examiné aux rayons UV (dans ce cas, les lentilles sont en verre de quartz et l'enregistrement est effectué sur un film photographique ou sur un écran fluorescent spécial).
3. Mesurer la taille d'objets microscopiques.À l'aide d'un microscope, vous pouvez déterminer la taille de l'objet observé. Un micromètre oculaire est utilisé pour cela. Le micromètre oculaire le plus simple est une plaque de verre ronde sur laquelle est appliquée une échelle graduée. Le micromètre est installé dans le plan de l'image obtenue à partir de l'objectif. Lorsqu'elles sont vues à travers l'oculaire, les images de l'objet et de l'échelle fusionnent et vous pouvez calculer quelle distance sur l'échelle correspond à la valeur mesurée. Le prix de division du micromètre oculaire est préalablement déterminé à partir d'un objet connu.
4. Microprojection et microphotographie.À l'aide d'un microscope, vous pouvez non seulement observer un objet à travers un oculaire, mais aussi le photographier ou le projeter sur un écran. Dans ce cas, des oculaires spéciaux sont utilisés, qui projettent l'image intermédiaire A"B" sur le film ou l'écran.
5. Ultramicroscopie. Le microscope peut détecter des particules dont la taille dépasse sa résolution. Cette méthode utilise un éclairage oblique, grâce auquel les microparticules sont visibles sous forme de points clairs sur un fond sombre, tandis que la structure des particules ne peut pas être vue, le fait de leur présence ne peut qu'être établi.
La théorie montre que, quelle que soit la puissance du microscope, tout objet inférieur à 3 microns y sera représenté simplement par un seul point, sans aucun détail. Mais cela ne signifie pas que ces particules ne peuvent pas être vues, que leurs mouvements peuvent être surveillés ou qu’elles ne peuvent pas être comptées.
Pour observer des particules dont la taille est inférieure à la limite de résolution du microscope, un appareil appelé ultramicroscope. La partie principale de l'ultramicroscope est un dispositif d'éclairage puissant ; Les particules ainsi éclairées sont observées dans un microscope ordinaire. L'ultramicroscopie est basée sur le fait que de petites particules en suspension dans un liquide ou un gaz sont rendues visibles sous un fort éclairage latéral (pensez aux particules de poussière visibles dans un rayon de soleil).
25.8. Concepts et formules de base
Fin de tableau
25.8. Tâches
1. Comme objectif de microscope, on utilise une lentille d'une distance focale de 0,8 cm avec une distance focale d'oculaire de 2 cm. La longueur optique du tube est de 18 cm. Quel est le grossissement du microscope ?
2.
Déterminer la limite de résolution des lentilles sèches et à immersion (n = 1,55) avec une ouverture angulaire u = 140 o. Prenez la longueur d’onde comme étant de 0,555 µm.
3.
Quelle est la limite de résolution à la longueur d’onde ? λ
= 0,555 µm, si l'ouverture numérique est : A 1 = 0,25, A 2 = 0,65 ?
4.
Quel indice de réfraction un liquide d'immersion doit-il être utilisé pour visualiser un élément subcellulaire d'un diamètre de 0,25 µm au microscope lorsqu'il est observé à travers un filtre orange (longueur d'onde 600 nm) ? L'angle d'ouverture du microscope est de 70°.
5.
Il y a une inscription « x10 » sur le bord de la loupe. Déterminez la distance focale de cette loupe.
6.
Distance focale de l'objectif du microscope f 1 = 0,3 cm, longueur du tube Δ
= 15 cm, grossissement Г = 2500. Trouver la distance focale F 2 de l'oculaire. La meilleure distance de vision est de 0 = 25 cm.
Des lignes directrices
Pour étudier des objets de petite taille et impossibles à distinguer à l'œil nu, des instruments optiques spéciaux sont utilisés - des microscopes. Selon la finalité, on les distingue : simplifiés, fonctionnels, de recherche et universels. Selon la source d'éclairage utilisée, les microscopes sont divisés en : lumineux, fluorescent, ultraviolet, électronique, neutronique, à balayage, tunnel. La conception de chacun des microscopes répertoriés comprend des pièces mécaniques et optiques. La partie mécanique sert à créer les conditions d'observation - placement de l'objet, focalisation de l'image, la partie optique - obtention d'une image agrandie.
Appareil de microscope optique
Un microscope est appelé microscope optique car il permet d'étudier un objet en lumière transmise dans un champ de vision lumineux. (Fig. Vue externe de Biomed 2) montre une vue générale du microscope Biomed-2.
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La partie mécanique du microscope se compose d'une base de microscope, d'une platine mobile et d'un dispositif rotatif.
La mise au point sur un objet s'effectue en déplaçant la scène en tournant les boutons de réglage grossier et fin.
La plage de mise au point grossière du microscope est de 40 mm.
Le condenseur est monté sur un support et situé entre la platine objet et la lentille collectrice. Son mouvement s'effectue en tournant le bouton de réglage de la hauteur du condenseur. Sa vue générale est représentée sur (Fig.???) Un condenseur à deux lentilles avec une ouverture de 1,25 fournit un éclairage des champs sur l'objet lorsque vous travaillez avec des lentilles avec un grossissement de 4 à 100 fois.
La table d'objets est montée sur un support. Le mouvement coordonné de la table d'objets est possible en tournant les poignées. L'objet est fixé à la table à l'aide de supports à médicaments. Les supports peuvent être déplacés les uns par rapport aux autres.
Les coordonnées de l'objet et l'ampleur du mouvement sont mesurées sur des échelles avec une valeur de division de 1 mm et des verniers avec une valeur de division de 0,1 mm. La plage de mouvement de l'objet dans le sens longitudinal est de 60 mm, dans le sens transversal – 40 mm. Condenseur
Condenseur
Le microscope est équipé d'une unité de montage à condenseur avec possibilité de mouvement de centrage et de focalisation.
Le microscope de base utilise un condenseur universel installé dans un support ; lors de l'utilisation d'huile d'immersion, l'ouverture numérique est de 1,25.
Lors du réglage de l'éclairage, un changement en douceur de l'ouverture numérique du faisceau de rayons éclairant le médicament est effectué à l'aide du diaphragme d'ouverture.
Le condenseur est installé dans le support du condenseur dans une position fixe et fixé avec une vis de verrouillage.
Les vis de centrage du condenseur sont utilisées pendant le processus de réglage de l'éclairage pour déplacer le condenseur dans un plan perpendiculaire à l'axe optique du microscope tout en centrant l'image du diaphragme de champ par rapport aux bords du champ de vision.
La poignée haut et bas du condenseur, située sur le côté gauche du support du support du condenseur, est utilisée lors du réglage de l'éclairage pour se concentrer sur l'image du diaphragme de champ.
Les filtres sont installés dans un anneau rotatif situé au bas du condenseur.
Partie optique du microscope
Se compose de systèmes d’éclairage et d’observation. Le système d'éclairage éclaire uniformément le champ de vision. Le système d'observation est conçu pour agrandir l'image de l'objet observé.
Système d'éclairage
Il est situé sous la table des objets. Il se compose d'une lentille collectrice installée dans le corps, qui est vissée dans le trou de la base du microscope et d'une douille dans laquelle est installée une lampe. La douille de la lampe est installée à l'intérieur de la base du microscope. L'illuminateur du microscope est alimenté par un réseau de courant alternatif via un cordon d'alimentation à trois broches connecté à l'alimentation électrique à l'aide d'une fiche. La lampe éclairante est allumée par un interrupteur situé sur la base du microscope.
Système d'observation
Se compose de lentilles, d'un accessoire monoculaire et d'oculaires.
Lentilles
Les lentilles constituent la partie la plus importante, la plus précieuse et la plus fragile du microscope. Le grossissement, la résolution et la qualité de l’image en dépendent. Il s'agit d'un système de lentilles mutuellement centrées et enfermées dans une monture métallique. À l'extrémité supérieure du cadre se trouve un filetage avec lequel la lentille est montée dans la douille du revolver. La lentille avant (la plus proche de l'objet) de l'objectif est appelée lentille frontale et est la seule de l'objectif à produire un grossissement. Tous les autres objectifs sont appelés objectifs de correction et servent à corriger les défauts de l'image optique.
Lorsqu'un faisceau de rayons lumineux de différentes longueurs d'onde traverse les lentilles, une coloration arc-en-ciel de l'image se produit - une aberration chromatique. La réfraction inégale des rayons sur la surface incurvée de la lentille entraîne une aberration sphérique, due à une réfraction inégale des rayons centraux et périphériques. En conséquence, l’image du point apparaît comme un cercle flou.
Les lentilles incluses dans le kit microscope sont conçues pour une longueur de tube optique de 160 mm, une hauteur de 45 mm et une épaisseur de verre de protection de mm.
Les objectifs avec un grossissement supérieur à 10X sont équipés de cadres à ressort qui protègent l'échantillon et les lentilles frontales des dommages lors de la mise au point sur la surface de l'échantillon.
Une bague colorée peut être appliquée sur le corps de l'objectif en fonction du grossissement, ainsi que :
- ouverture numérique;
- longueur du tube optique 160 ;
- épaisseur du verre de protection 0,17, 0 ou －" ;
- type d'immersion - huile HUILE (MI) ou eau VI ;
Les objectifs marqués 0,17 sont destinés à l'étude de préparations uniquement avec des lamelles de 0,17 mm d'épaisseur. Les objectifs marqués 0 sont destinés à l'étude de préparations uniquement sans lamelles. Des objectifs à faible grossissement (2,5 - 10), ainsi que des objectifs à immersion, peuvent être utilisés lors de l'examen de préparations avec ou sans couvre-objet. Ces objectifs sont marqués d'une icône －.
Oculaires
L'oculaire du microscope se compose de deux lentilles : une lentille oculaire (en haut) et une lentille collectrice (en bas). Entre les lentilles se trouve le diaphragme. Le diaphragme bloque les rayons latéraux et transmet ceux proches de l'axe optique, ce qui améliore le contraste de l'image. Le but de l'oculaire est d'agrandir l'image produite par l'objectif. Les oculaires ont leur propre grossissement de ×5, ×10, ×12,5, ×16 et ×20, indiqué sur la monture.
Le choix des oculaires dépend du jeu de lentilles utilisé. Lorsque vous travaillez avec des lentilles achromates, achrostigmates et achrofluaires, il est conseillé d'utiliser des oculaires avec un champ de vision linéaire ne dépassant pas 20 mm, avec des lentilles planchromates et planapochromates - oculaires avec un champ de vision linéaire de 20 ; 22 et 26,5 mm.
De plus, le microscope peut être équipé d'un oculaire WF10/22 avec échelle ; la valeur de division d'échelle est de 0,1 mm.
Caractéristiques des microscopes
Grossissement du microscope
Les principales caractéristiques d'un microscope incluent le grossissement et la résolution. Le grossissement total fourni par un microscope est défini comme le produit du grossissement de l'objectif et du grossissement de l'oculaire. Cependant, le grossissement n'indique pas la qualité de l'image ; elle peut être claire ou floue. La clarté de l'image résultante est caractérisée par la résolution du microscope, c'est-à-dire la plus petite taille d'objets ou de leurs parties pouvant être vus à l'aide de cet appareil.
Le grossissement total Г du microscope lors de l'observation visuelle est déterminé par la formule : Г = βok × βok, où :
βrev - grossissement de l'objectif (marqué sur l'objectif) ; βok - grossissement de l'oculaire (marqué sur l'oculaire).
Le diamètre du champ observé dans l'objet, Add mm, est déterminé par la formule : Add = Add × βob. Doc – diamètre du champ de vision oculaire (marqué sur l'oculaire) mm. Les valeurs calculées du grossissement du microscope et du diamètre du champ observé au niveau de l'objet sont données dans le tableau 3.
| Grossissement de l'objectif | Grossissement du microscope et champ observé sur un objet avec un oculaire : |
|||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 5/26* | 10/22 | 15/16* | ||||
| g | Ajouter, mm | g | Ajouter, mm | g | Ajouter, mm | |
| 4 | 20 | 4,0 | 50 | 4,5 | 64 | 3,75 |
| 10 | 50 | 2,0 | 100 | 1,8 | 160 | 1,5 |
| 20 | 100 | 1,0 | 200 | 0,9 | 320 | 0,75 |
| 40 | 200 | 0,5 | 420 | 0,45 | 640 | 0,38 |
| 100 | 500 | 0,2 | 1000 | 0,18 | 1600 | 0,15 |
- Par commande supplémentaire
Résolution du microscope
La résolution d'un microscope est déterminée par la distance minimale (de résolution) entre deux points (ou deux lignes les plus fines) visibles séparément et est calculée par la formule
D=λ/(A1+A2) , où d est la distance minimale (résolution) entre deux points (lignes) ; λ est la longueur d'onde de la lumière utilisée ; A1 et A2 sont l'ouverture numérique de l'objectif (marquée sur son cadre) et du condenseur.
Vous pouvez augmenter la résolution (c'est-à-dire réduire la valeur absolue de d, puisqu'il s'agit de valeurs réciproques) des manières suivantes : éclairer l'objet avec une lumière avec une longueur d'onde λ plus courte (par exemple, des rayons ultraviolets ou à ondes courtes), utiliser des lentilles avec une plus grande ouverture A1, ou augmenter l'ouverture du condenseur A2.
Distance de travail de l'objectif
Les microscopes sont équipés de quatre objectifs amovibles avec leurs propres grossissements de 4×, 10×, 40× et 100×, marqués sur un cadre métallique. Le grossissement de l'objectif dépend de la courbure de la lentille frontale principale : plus la courbure est grande, plus la distance focale est courte et plus le grossissement est grand. Il faut en tenir compte lors de la microscopie : plus le grossissement fourni par la lentille est grand, plus la distance de travail libre est petite et plus elle doit être abaissée au-dessus du plan de l'échantillon.
Immersion
Toutes les lentilles sont divisées en lentilles sèches et à immersion, ou submersibles. Une lentille est dite sèche s’il y a de l’air entre la lentille frontale et l’échantillon en question. Dans ce cas, en raison de la différence d’indice de réfraction du verre (1,52) et de l’air (1,0), une partie des rayons lumineux est déviée et n’entre pas dans l’œil de l’observateur. Les lentilles à système sec ont généralement une longue focale et offrent un grossissement faible (10x) ou moyen (40x).
Les lentilles à immersion ou submersibles sont les lentilles dans lesquelles un milieu liquide avec un indice de réfraction proche de l'indice de réfraction du verre est placé entre la lentille frontale et l'échantillon. L'huile de cèdre est généralement utilisée comme milieu d'immersion. Vous pouvez également utiliser de l'eau, de la glycérine, des huiles transparentes, du monobromonaphtalène, etc. Dans ce cas, un milieu homogène (homogène) s'établit entre la lentille frontale de l'objectif et la préparation (verre de la préparation - huile - verre de l'objectif) avec le même indice de réfraction. Grâce à cela, tous les rayons, sans réfraction ni changement de direction, pénètrent dans la lentille, créant ainsi les conditions d'un meilleur éclairage du médicament. La valeur (n) de l'indice de réfraction est de 1,33 pour l'eau, de 1,515 pour l'huile de cèdre et de 1,6 pour le monobromonaphtalène.
Technique de microscopie
Le microscope est connecté au réseau électrique à l'aide d'un câble d'alimentation. À l'aide d'un revolver, une lentille avec un grossissement de ×10 est installée dans le trajet du faisceau. Un léger arrêt et le cliquetis du ressort revolver indiquent que l'objectif est monté le long de l'axe optique. À l'aide du bouton de mise au point grossière, abaissez l'objectif à une distance de 0,5 à 1,0 cm de la scène.
Règles pour travailler avec des lentilles sèches.
La préparation préparée est posée sur la scène et fixée avec une pince. Plusieurs champs de vision sont visualisés à l’aide d’une lentille sèche ×10. La scène est déplacée à l'aide de vis latérales. La zone du médicament nécessaire à l'examen est placée au centre du champ de vision. Soulevez le tube et, en tournant le revolver, déplacez la lentille avec un grossissement de ×40, en observant de côté, à l'aide d'une vis macrométrique, abaissez à nouveau le tube avec la lentille presque jusqu'à ce qu'il entre en contact avec l'échantillon. Regardez dans l'oculaire et soulevez très lentement le tube jusqu'à ce que le contour de l'image apparaisse. La mise au point précise s'effectue à l'aide d'une vis micrométrique, en la tournant dans un sens ou dans l'autre, mais pas plus d'un tour complet. Si une résistance se fait sentir lors de la rotation de la vis micrométrique, cela signifie que sa course est terminée. Dans ce cas, tourner la vis d'un ou deux tours complets dans le sens opposé, retrouver l'image à l'aide de la vis macrométrique et procéder au travail avec la vis micrométrique.
Il est utile de s'habituer à garder les deux yeux ouverts lors de la microscopie et à les utiliser alternativement, car cela fatiguera moins votre vue.
Lors du changement d'objectif, il ne faut pas oublier que la résolution du microscope dépend du rapport entre l'ouverture de l'objectif et le condenseur. L'ouverture numérique de l'objectif avec un grossissement ×40 est de 0,65 et celle du condenseur non immergé est de 0,95. Il est pratiquement possible de les mettre en correspondance en utilisant la technique suivante : après avoir focalisé l'échantillon avec la lentille, retirer l'oculaire et, en regardant à travers le tube, recouvrir le diaphragme à iris du condenseur jusqu'à ce que ses bords deviennent visibles au bord du diaphragme uniforme. lentille arrière éclairée de l'objectif. À ce stade, les ouvertures numériques du condenseur et de l’objectif seront approximativement égales.
Règles pour travailler avec une lentille à immersion.
Une petite goutte d'huile à immersion est appliquée sur la préparation (de préférence fixée et colorée). Le revolver tourne et une lentille à immersion avec un grossissement de 100× est installée le long de l'axe optique central. Le condenseur est soulevé jusqu'à ce qu'il s'arrête. Le diaphragme à iris du condenseur est complètement ouvert. En regardant de côté, utilisez une vis macrométrique pour abaisser le tube jusqu'à ce que la lentille soit immergée dans l'huile, presque jusqu'à ce que la lentille entre en contact avec la lame de l'échantillon. Cela doit être fait avec beaucoup de précautions afin que la lentille frontale ne bouge pas et ne soit pas endommagée. Ils regardent dans l'oculaire, font tourner très lentement la vis macrométrique vers eux et, sans sortir la lentille de l'huile, soulèvent le tube jusqu'à ce que les contours de l'objet apparaissent. Il ne faut pas oublier que la distance de travail libre dans la lentille à immersion est de 0,1 à 0,15 mm. Ensuite, une mise au point précise est réalisée à l'aide d'une vis macrométrique. Plusieurs champs de vision sont examinés lors de la préparation, en déplaçant la table avec des vis latérales. Une fois le travail terminé avec la lentille à immersion, soulevez le tube, retirez la préparation et essuyez soigneusement la lentille frontale de la lentille, d'abord avec une serviette en coton doux et sec, puis avec la même serviette, mais légèrement humidifiée avec de l'essence pure. Vous ne devez pas laisser d'huile sur la surface de la lentille, car elle permet à la poussière de se déposer et peut endommager l'optique du microscope au fil du temps. La préparation est d'abord débarrassée de l'huile avec un morceau de papier filtre, puis le verre est traité avec de l'essence ou du xylène.
doctorat Egorova O.V.,
expert de la norme d'État de la Fédération de Russie sur les instruments optiques
Le microscope est l'un des principaux instruments permettant de réaliser des études cytologiques. La qualité de son fonctionnement, en tant que système optique complexe, est déterminée par les caractéristiques technologiques de l'appareil et de ses éléments. La qualité de l'image est principalement déterminée par la nature de la construction de l'image du médicament par le flux lumineux qui le traverse. Selon la théorie de la formation d'images dans un microscope, créée par l'entreprise de Carl Zeiss par le mathématicien et physicien Ernst Abbe (1840-1905) [montrer] en 1872, une image est une combinaison des propriétés de diffraction et d’interférence de la lumière.
2005 a été déclarée Année de l'Abbé pour sa contribution au développement de l'instrumentation optique et pour l'organisation de la Fondation Carl ZEISS, qui a réuni l'usine de fabrication d'instruments Zeiss et l'usine de verre Schott.
Ces deux propriétés affectent la qualité de l'image et la précision de l'objet dans l'image, et August Köhler (1866-1948) a publié des lignes directrices pour l'éclairage correct des lames microscopiques en 1883.
D'autre part, la qualité d'image d'un système optique dépend aussi de sa perfection technologique (présence d'aberrations résiduelles - distorsions, défauts du verre), de son assemblage et de son alignement.
Une caractéristique quantitative importante de la qualité de l’image est la résolution. Les distorsions résiduelles provoquent une redistribution de l'énergie lumineuse dans le diagramme de diffraction, et les défauts internes de la lentille (et de l'ensemble du système optique du microscope) conduisent à la formation de lumière diffusée nocive et à une distorsion géométrique du diagramme de diffraction, superposée à l'image optique. , ce qui réduit la résolution et le contraste de l’image.
La résolution d'un système optique est sa propriété de représenter séparément deux points ou deux lignes situés dans l'espace des objets. La mesure de la résolution est la plus petite distance linéaire ou angulaire entre deux points (lignes) dont les images sont construites séparément par le système optique.
Un système optique est considéré comme parfait si sa résolution est limitée uniquement par la diffraction de la lumière sur les bords de la monture de l'objectif ou du diaphragme d'ouverture du condenseur. La diffraction de la lumière, en raison de la nature ondulatoire de la lumière, perturbe la propagation rectiligne de la lumière ; un point lumineux est représenté par une tache ronde, appelée cercle d'Air, entourée d'anneaux sombres et clairs de luminosité décroissante. Environ 84 % de l’énergie lumineuse est concentrée dans le point central, 7 % dans le premier point lumineux et 9 % dans les anneaux restants. Rayon R.(Fig. 1) du premier anneau sombre dans le plan image est déterminé par l'expression p = 1,22λ f, / D(1), où λ est la longueur d’onde de la lumière ; f, - distance focale du système optique ; D est le diamètre du trou de fonctionnement du système (ouverture).
Ordre de grandeur R.égale à la distance entre les centres de l'image de deux points A et B ; R. peut être déterminé par la formule р = 0,61λ/sinσ, , (2), où σ est l'angle d'ouverture dans l'espace image.
À λ = 0,560 µm = 560 nm p = 0,34 / σ, où R. mesuré en micromètres.
Les images de deux points lumineux construites par le système optique sont deux taches aux bords flous. Au fur et à mesure que les points se rapprochent, les spots se touchent puis se chevauchent puis fusionnent (Fig. 1).
L'œil peut voir deux points séparément dans le plan de l'image à une certaine distance minimale R. entre eux et la différence d'éclairement requise au point minimum UN et les maxima A ou B. La sensibilité au contraste pour l'œil moyen est de 5 %. Rapport d'éclairement en un point UNà l'éclairage en un point UN ou DANS atteint 85%.
La résolution des systèmes optiques est déterminée à l'aide de lignes ou de lignes radiales réalisées sur des plaques de verre (Fig. 2). Des traits ou secteurs clairs sont appliqués sur un fond sombre à l'aide d'une méthode photolithographique. Ils produisent des mondes de lignes standard de six nombres (pour évaluer la résolution des objectifs de caméra et d'autres instruments et composants optiques) et du numéro 0 pour l'évaluation par autocollimation de la résolution des objectifs de microscope. Chaque monde est constitué de 25 éléments, numérisés le long des bords et comportant quatre groupes de traits dont la largeur varie d'un élément à l'autre. La largeur du trait s'entend comme la distance axiale entre deux bandes sombres ou claires adjacentes, c'est-à-dire que la largeur totale des bandes sombres et claires est égale à la largeur d'un trait. Tous les mondes standards ont un contraste absolu K = 1.
La résolution d'un objectif de microscope est déterminée linéairement. Pour les objets non autolumineux, limite de résolution d = λ/A(3), où UN- ouverture numérique égale au produit de l'indice de réfraction n du milieu entre la lentille et l'objet et sinσ.
Lors de l'observation d'une structure périodique, la distance la plus courte d, selon la théorie d'Abbe, dépend de l'ouverture de l'objectif et de l'ouverture du condenseur : d = λ / (A + Ak), (4), où Un k- ouverture numérique du condenseur.
Si l'ouverture du condenseur est égale à l'ouverture de l'objectif, alors la résolution du microscope pour les objets autolumineux est déterminée par la formule d = λ / (2A) (5)
| Tableau 1. Valeurs estimées de résolution de l'objectif | |||||||
| Et à propos | λ = 400 nm | λ = 550 nm | λ = 700 nm | ||||
| P1 | R2 | P1 | R2 | P1 | R2 | ||
| 0,025 | 8,0 | 9,76 | 11,0 | 17,08 | 13,42 | 14,0 | |
| 0,075 | 2,67 | 3,25 | 3,67 | 5,69 | 4,47 | 4,67 | |
| 0,10 | 2,0 | 2,44 | 2,75 | 4,27 | 3,36 | 3,5 | |
| 0,12 | 1,67 | 2,03 | 2,29 | 3,56 | 2,8 | 2,92 | |
| 0,20 | 1,0 | 1,22 | 1,3 | 1,67 | 1,75 | 2,13 | |
| 0,25 | 0,8 | 0,98 | 1,10 | 1,71 | 1,34 | 1,4 | |
| 0,30 | 0,67 | 0,81 | 0,92 | 1,42 | 1,12 | 1,17 | |
| 0,40 | 0,5 | 0,61 | 0,66 | 1,07 | 0,84 | 0,87 | |
| 0,45 | 0,44 | 0,54 | 0,62 | 0,95 | 0,74 | 0,78 | |
| 0,50 | 0,4 | 0,49 | 0,55 | 0,85 | 0,67 | 0,7 | |
| 0,65 | 0,31 | 0,37 | 0,42 | 0,66 | 0,52 | 0,54 | |
| 0,75 | 0,27 | 0,32 | 0,36 | 0,57 | 0,45 | 0,47 | |
| 0,80 | 0,25 | 0,305 | 0,34 | 0,53 | 0,42 | 0,44 | |
| 0,85 | 0,23 | 0,29 | 0,32 | 0,5 | 0,39 | 0,41 | |
| 0,90 | 0,22 | 0,27 | 0,31 | 0,47 | 0,37 | 0,39 | |
| 0,95 | 0,21 | 0,26 | 0,29 | 0,45 | 0,35 | 0,37 | |
| 1,0 | 0,126 | 0,126 | 0,174 | 0,221 | 0,174 | 0,221 | |
| 1,20 | 0,105 | 0,105 | 0,145 | 0,184 | 0,145 | 0,184 | |
| 1,25 | 0,101 | 0,101 | 0,139 | 0,177 | 0,139 | 0,177 | |
| 1,30 | 0,097 | 0,097 | 0,134 | 0,17 | 0,134 | 0,17 | |
| 1,40 | 0,09 | 0,09 | 0,124 | 0,158 | 0,124 | 0,158 | |
| 1,45 | 0,087 | 0,087 | 0,120 | 0,152 | 0,120 | 0,152 | |
| P 1 - calcul selon la formule (5) | P 2 - calcul selon la formule (2) | ||||||
Il convient de noter que plus les études sont détaillées, plus la qualité estimée de la lentille et du condenseur (système d'éclairage) doit être comparable. Par exemple, les nouveaux microscopes de recherche et universels "Axio Imager" ont une conception fondamentale de l'optique IC2S, qui égalise la qualité de la lentille et du système d'éclairage.
Des formules ci-dessus, il s'ensuit que plus la longueur d'onde de la lumière est courte et plus l'ouverture de la lentille est grande, plus la résolution de la lentille du microscope est élevée.
Pour augmenter la résolution d'un microscope, des liquides d'immersion peuvent être utilisés pour remplir l'espace entre l'objet en question et la lentille du microscope. Grâce à cela, l'ouverture numérique de l'objectif du microscope peut être augmentée jusqu'à 1,45 et la distance maximale résolue à λ = 0,56 μm - à d = 0,17 μm.
L'augmentation de la résolution est influencée par le rapport entre le flux lumineux traversant la préparation (ouverture du condenseur) et perçu par l'objectif (ouverture de l'objectif). Si le médicament contraste (après traitement et coloration de la manière appropriée), alors selon le principe de Köhler, lors du réglage de l'éclairage, il est permis d'ouvrir le diaphragme d'ouverture du condenseur à la valeur de l'ouverture numérique de l'objectif, ou d'utiliser un diaphragme à iris, la taille du diaphragme d'ouverture du condenseur peut être réduite de 1/3.
Ainsi, la valeur de résolution peut être calculée en utilisant respectivement la formule (5) et la formule (2). Par conséquent, lorsque vous travaillez avec un objectif A = 1,25, vous pouvez utiliser un condenseur avec à la fois une ouverture numérique A = 0,9 (sec, la résolution est calculée par la formule 2) et A = 1,25 (immersion, la résolution est calculée par la formule 5), faites ne pas oublier que pour obtenir A = 1,25 il faut « goutter » de l'huile d'immersion sur le condenseur.
Dans le tableau La figure 1 présente les valeurs de résolution calculées des lentilles traditionnellement utilisées pour la recherche biomédicale.
En figue. La figure 3 montre des exemples d'images avec un microscope correctement configuré (a) et avec un système d'éclairage de microscope mal configuré (b, c). Comme vous pouvez le constater, des réglages incorrects affectent la résolution du microscope, ainsi que la précision du transfert des éléments médicamenteux dans son image.
Comme déjà mentionné, la résolution peut être augmentée grâce à l'utilisation de filtres de couleur. Les couleurs traditionnelles sont le bleu, le vert, le jaune et le rouge. Cependant, si le bleu et le vert augmentent réellement la résolution, alors le jaune et le rouge augmentent le contraste, c'est-à-dire qu'ils accentuent la différence entre l'environnement et la préparation.
Ainsi, la résolution dans un microscope est influencée par :
- paramètres de l'objectif (ouverture numérique de l'objectif) ;
- la possibilité de régler l'éclairage Koehler (diaphragmes de champ et d'ouverture réglables, mouvement de focalisation du condenseur et possibilité de le centrer, possibilité de centrer le filament de la lampe si la lampe n'est pas auto-centrée) ;
- qualité de l'optique du microscope (calcul et technologique) ;
- l'utilisation de filtres de lumière dans la région des ondes courtes du spectre (de l'UV au vert).
Source: I.P. Shabalova, T.V. Dzhangirova, N.N. Volchenko, K.K. Pougatchev. Atlas cytologique : Diagnostic des maladies du sein. - M.-Tver : Triada Publishing House LLC, 2005
Microscope comme dispositif optique. Pouvoir de résolution du microscope.
Un microscope (du micro... et du grec skopeo - je regarde) est un appareil optique permettant d'obtenir une image très agrandie d'un très petit objet étudié, invisible à l'œil nu. À l'aide d'un microscope, vous pouvez examiner de petits détails de la structure d'un objet dont les dimensions dépassent la résolution de l'œil.
L'œil humain est un système optique naturel caractérisé par une certaine résolution. La résolution d'un système optique est la plus petite distance entre les éléments de l'objet observé, à laquelle ces éléments peuvent encore être distingués les uns des autres (par éléments d'objet, nous entendons des points ou des lignes).
Si l'objet est retiré à la distance dite de meilleure vision, qui est de 250 mm, alors pour un œil humain normal, la résolution minimale est d'environ 0,1 mm, et pour de nombreuses personnes, elle est d'environ 0,2 mm. Cela correspond à peu près à l'épaisseur d'un cheveu humain. La taille des objets, tels que les cellules végétales et animales, les petits cristaux, les détails de la microstructure des métaux et alliages, etc., est nettement inférieure à 0,1 mm. De tels objets sont généralement appelés microobjets. Différents types de microscopes sont conçus pour observer et étudier de tels objets. À l’aide d’un microscope, la forme, la taille, la structure et bien d’autres caractéristiques des microobjets sont déterminées. Un microscope optique permet de distinguer des structures avec une distance entre éléments allant jusqu'à 0,20 µm, c'est-à-dire La résolution d'un tel microscope est d'environ 0,20 µm ou 200 nm.
Lorsqu’ils parlent du pouvoir de résolution d’un microscope, ils entendent, tout comme le pouvoir de résolution de l’œil humain, une image distincte de deux objets proches. Cependant, vous devez comprendre que la résolution et le grossissement ne sont pas la même chose. Par exemple, si vous utilisez systèmes de visualisation Si nous obtenons des photographies de deux lignes à partir d'un microscope optique situé à une distance inférieure à 0,20 microns (c'est-à-dire inférieure à la résolution du microscope), quelle que soit la façon dont nous agrandissons l'image, les lignes fusionneront toujours en une seule. Ceux. nous pourrons obtenir un grossissement élevé, mais nous n'améliorerons pas sa résolution. Le grossissement total du microscope est égal au produit du grossissement linéaire de l'objectif et du grossissement angulaire de l'oculaire. Les valeurs de grossissement sont gravées sur les montures d'objectif et d'oculaire. Considérons un microscope à champ plat (non stéréoscopique). Ce sont des microscopes biologiques, métallographiques, polarisants. Habituellement, les objectifs d'un tel microscope ont des grossissements de 4 à 100 fois et les oculaires de 5 à 16. Par conséquent, le grossissement total d'un microscope optique varie de 20 à 1 600 fois. Bien sûr, il est techniquement possible de développer et d'utiliser des lentilles et des oculaires dans un microscope qui donneront un grossissement total bien supérieur à 1600x (par exemple, il existe des oculaires avec un grossissement de 20x qui, lorsqu'ils sont associés à un objectif de 100x, donneront un grossissement de 2000x). Cependant, cela n’est généralement pas pratique. Les forts grossissements ne sont pas une fin en soi pour la microscopie optique. Le but du microscope est d'assurer la distinction des éléments les plus petits possibles de la structure du médicament, c'est-à-dire en maximisant la résolution du microscope. Et cela a une limite en raison des propriétés ondulatoires de la lumière. Ainsi, une distinction est faite entre le grossissement utile et inutile du microscope. Un grossissement utile se produit lorsqu'il est possible d'identifier de nouveaux détails de la structure d'un objet, et un grossissement inutile est une augmentation dans laquelle, en grossissant l'objet des centaines de fois ou plus, il est impossible de détecter de nouveaux détails de la structure de l'objet.
Arrêtons-nous encore une fois sur la notion de résolution. La résolution des dispositifs optiques (également appelée pouvoir séparateur) caractérise la capacité de ces dispositifs à produire des images distinctes de deux points d'un objet proches l'un de l'autre. La plus petite distance linéaire ou angulaire entre deux points à partir desquels leurs images fusionnent est appelée limite de résolution linéaire ou angulaire. L'existence d'une limite au pouvoir de résolution affecte le choix des grossissements que l'on obtient avec un microscope. Les grossissements jusqu’à 1250 fois sont considérés comme utiles, car ils permettent de distinguer tous les éléments de la structure de l’objet. Dans ce cas, les capacités de résolution du microscope sont épuisées. Ce grossissement est obtenu à l'aide d'un objectif à immersion dans l'huile 100x et d'un oculaire 12,5x (le grossissement oculaire utile varie de 7,5 à 12,5x). À des grossissements supérieurs à 1 250 fois, aucun nouveau détail sur la structure du médicament n’est révélé. Cependant, de tels grossissements sont parfois utilisés - en microphotographie, lors de la projection d'images sur un écran et dans certains autres cas.
Lorsqu’un grossissement utile nettement plus élevé est nécessaire, un microscope électronique est utilisé. Ce microscope a une résolution nettement supérieure à celle d'un microscope optique. Un microscope électronique est un appareil permettant d'observer et de photographier des images d'objets agrandies plusieurs fois (jusqu'à 106 fois), dans lesquelles au lieu de rayons lumineux, des faisceaux d'électrons sont utilisés, accélérés à des énergies élevées (30-100 keV ou plus) en profondeur conditions de vide.
Classification des microscopes optiques et de leurs domaines d'application
Selon la structure du circuit optique Il existe des microscopes directs (les lentilles, l'accessoire et les oculaires sont situés au-dessus de l'objet) et inversés (l'objet est situé au-dessus du système optique qui forme l'image). Distinguer également microscopes à champ plat(donnant une image en deux dimensions) et microscopes stéréoscopiques(volumétrique - image tridimensionnelle).
Par méthodes d'éclairage les microscopes séparent la lumière transmise (une image est formée par la lumière traversant un objet) et la lumière réfléchie (une image est formée par la lumière réfléchie par la surface d'un objet).
Les microscopes peuvent également être divisés par méthodes de recherche :
Champ clair (un objet plus sombre se détache sur un fond clair) ;
Champ sombre (un objet clair ou ses structures de bord se détachent sur un fond sombre) ;
Contraste de phase (un objet en relief gris foncé est observé sur un fond gris clair) ;
Luminescence (des objets ou parties d'objet lumineux se détachent sur un fond sombre) ;
Lumière polarisée (une image d'un objet brillamment coloré dans diverses couleurs ou nuances est observée).
On distingue les domaines d'application suivants des microscopes optiques :
Microscopes biologiques pour la recherche biologique et médicale en laboratoire d'objets transparents. Disponible en modes fond clair, fond noir, contraste de phase, polarisé et fluorescent.
Microscopes stéréoscopiques dans les laboratoires et diverses industries pour obtenir des images agrandies d'objets lors d'opérations de travail. Peut fonctionner en lumière réfléchie et transmise. Les modes de champ clair et sombre sont disponibles.
Microscopes métallographiques dans les laboratoires scientifiques et industriels pour l'étude d'objets opaques. Travailler en lumière réfléchie. Les modes champ clair et sombre, contraste de phase et lumière polarisée sont disponibles.
Microscopes polarisants dans les laboratoires scientifiques et de recherche pour des études spécialisées en lumière polarisée. Peut fonctionner en lumière réfléchie et transmise. Les modes de champ clair et sombre sont disponibles.
Objectifs et oculaires pour microscopes
Lentille de microscope - une microlentille est un système optique complexe qui forme une image agrandie d'un objet et constitue la partie principale et la plus importante du microscope. La microlentille produit une véritable image inversée qui est vue à travers l'oculaire.
Les objectifs diffèrent par leurs caractéristiques optiques et leur conception :
Selon le degré de correction de l'aberration chromatique : achromates, apochromates, etc.
Avec courbure d'image corrigée : - planachromates, planapochromates.
La longueur du tube du microscope est de 160 mm pour la lumière transmise, 190 mm pour la lumière réfléchie, l'infini pour la lumière transmise et réfléchie ;
Selon les propriétés d'immersion : systèmes secs (sans immersion) et systèmes immergés.
Les objectifs apochromatiques diffèrent des objectifs achromatiques par le degré de correction de l'aberration chromatique. Grâce à une élimination plus poussée des défauts d'image liés à l'aberration chromatique, la qualité d'image obtenue lors de l'observation d'objets colorés (coupes colorées, micro-organismes, etc.), notamment à fort grossissement, est nettement supérieure lors de l'utilisation d'apochromates. Les apochromates, ainsi que les achromates à fort grossissement, sont utilisés conjointement avec des oculaires de compensation. Les apochromates ont généralement un APO gravé sur leur cadre. Dans les achromats et les apochromates, notamment à fort grossissement, la courbure du champ de l'image n'est pas corrigée.
